CRISPR-Cas9

Definitions & Key takeaways

CRISPR/Cas9 is a gene-editing technology that has generated tremendous excitement in the scientific community. It is a relatively simple and inexpensive way to modify organisms genetically and has already been used to edit genes in human cells.

The CRISPR/Cas9 system comprises two components: CRISPR, which acts as a guide RNA; and Cas9, which is a DNA endonuclease, meaning an enzyme that cuts DNA. CRISPR binds to specific DNA sequences, called targets, and directs Cas9 to cut the target sequence. This can be used to delete or replace specific genes or correct mutations.

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Pocas técnicas de laboratorio han llamado tanto la atención como CRISPR/Cas9. Y, en cierto modo, todo el mundo ha oído hablar de lo que puede hacer esta herramienta: editar genes o, en pocas palabras, modificar el ADN.
Con la edición de genes se introducen cambios específicos, como supresiones e inserciones, en el genoma de un organismo.
En la última década, el sistema CRISPR-Cas9 se ha convertido en un método muy popular de edición del genoma, porque es rápido, barato, preciso y relativamente fácil de usar.
A nivel molecular, el ADN está formado por dos hebras de nucleótidos, por lo que cada gen no es más que un segmento de esta secuencia de nucleótidos.
Los nucleótidos del ADN están formados por un azúcar, la desoxirribosa, un fosfato y una de las cuatro bases nucleicas, la adenina, la citosina, la guanina y la timina, o A, C, G y T.
Los nucleótidos de una hebra se emparejan mediante enlaces de hidrógeno con los nucleótidos de la hebra opuesta para crear la doble hebra de ADN: concretamente, la A se une a la T y la C a la G, por lo que se denominan bases complementarias y forman los pares de bases.
Ahora bien, una sola cadena de ADN también puede formar enlaces con una sola cadena de ARN, formada por un azúcar -la ribosa-, un fosfato y una de las cuatro nucleobases, pero el ARN tiene uracilo, abreviado U, en lugar de T.
Así, cuando las secuencias complementarias en el ADN y el ARN se unen, A se une a U. En otras palabras, si el ADN tiene una secuencia que dice 5′ -GGCTAT- 3′, entonces la secuencia de ARN es exactamente la opuesta y se lee 3′ - CCGAUA -5′.
Ahora bien, de vez en cuando se producen roturas de doble cadena en el genoma. Cuando esto ocurre, la célula dispone de dos mecanismos principales de reparación para corregir el daño.
El más frecuente es la unión de extremos no homólogos, en la que un complejo proteico llamado proteína ADN cinasa comienza por unirse a cada extremo del ADN roto.
A continuación, recluta otra proteína, llamada artemisa (en honor a la diosa griega) para cortar los extremos de una sola hebra.
Es como utilizar papel de lija para alisar los extremos rotos del lápiz, de modo que este pueda volver a pegarse más fácilmente.
Por último, una enzima ligasa (que sería el pegamento) une los dos extremos del ADN. Como la artemisa corta algunos nucleótidos, la unión de extremos no homólogos es una reparación propensa a los errores, lo que conduce a una pérdida de información genética.
El otro mecanismo de reparación se denomina reparación dirigida por homología, que se basa en la recombinación homóloga.
Nuestros 46 cromosomas vienen en 23 pares de dos cromosomas homólogos, que codifican los mismos rasgos y, por tanto, tienen secuencias de nucleótidos similares.
De este modo, una rotura de doble cadena en uno de los cromosomas puede repararse utilizando la cromátida hermana. En primer lugar, un complejo proteico (llamado MRN) se une a cada extremo del ADN roto y recluta las exonucleasas que eliminan los nucleótidos de una hebra del ADN.
Para que el proceso sea más claro, podemos llamar a los extremos del ADN roto "extremo 1" y "extremo 2". El "extremo 1" se sitúa cerca de una secuencia de nucleótidos similar, llamada secuencia homóloga, porque se encuentra en el mismo lugar de la cromátida hermana homóloga.
El "extremo 1" se empareja entonces con la hebra complementaria de la región de ADN homóloga intacta, creando un bucle en el ADN homólogo.
A continuación, una ADN polimerasa sintetiza nucleótidos para extender el "extremo 1", hasta alcanzar una secuencia complementaria al "extremo 2".
A continuación, el extremo 1 libera el ADN homólogo y sus últimos nucleótidos se unen a los últimos nucleótidos del extremo 2.
Por último, la ADN polimerasa rellena los huecos a ambos lados de la unión y la ADN ligasa sella el enlace. Dado que la reparación por homología utiliza una cromátida hermana como molde, se trata de un mecanismo de reparación más fiable que la unión de extremos no homólogos, porque no hay pérdida de nucleótidos.CRISPR es la abreviatura de "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats" (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas).
Este término complejo significa que, dentro de algunos procariotas, como las bacterias y las arqueas, hay ciertas localizaciones en el genoma en las que una determinada secuencia de ADN se repite una y otra vez.
Entre estas repeticiones hay secuencias únicas, llamadas espaciadores. Cerca de estas localizaciones CRISPR se encuentran las proteínas asociadas a clústeres, o Cas, muchas de las cuales tienen actividades enzimáticas.
Aunque existen varios tipos de genes Cas, el más famoso es Cas9, por su utilidad en el sistema de edición genética CRISPR/Cas.
Cas9 es una endonucleasa de ADN, lo que significa que puede cortar el ADN, como unas tijeras moleculares. Ahora resulta que los espaciadores en las localizaciones CRISPR son una especie de registro histórico de virus de ADN que han infectado previamente al huésped.
Así, cuando un virus de ADN se introduce en una célula huésped, ciertos fragmentos del mismo, llamados protoespaciadores, se incorporan al genoma del huésped y se convierten en los espaciadores en las ubicaciones de CRISPR.
En cierto modo, se convierten en un registro molecular, algo así como una base de datos de "fichas policiales" de anteriores delincuentes virales.
Cuando una ubicación de CRISPR se transcribe en ARN, forma un ARNpre-CRISPR, o ARNpre-cr, compuesto por las secuencias complementarias de los espaciadores y las repeticiones.
Y en los fragmentos de las repeticiones que están en el extremo 3' de los complementos del espaciador, se une otro ARN, el ARNcr transactivador, o ARNtrat.
Juntos, reclutan enzimas que cortan el ARNprecr en trozos más pequeños y recortan el extremo 5' de esos trozos. Lo que queda son ARNcr maduros, cada uno formado por los complementos tanto de la repetición 3' como de unos 20 nucleótidos de un espaciador, todavía unido al ARNtracr.
Supongamos ahora que el virus vuelve a esa célula. Pues bien, Cas9 reconoce un motivo adyacente protoespaciador específico, o PAM para abreviar, que es una secuencia conservada de 2 a 5 pares de bases situada cerca de la secuencia complementaria del ARNcr.Si el complejo ARNcr/ARNtracr se une a su secuencia complementaria cerca de un PAM, ayuda a guiar a Cas9 para que trocee el ADN de doble cadena del infractor, como un ninja, 3 pares de bases por delante del PAM.
Esto provoca la destrucción del virus. En definitiva, el sistema CRISPR/Cas es una adaptación evolutiva contra las infecciones víricas del ADN.
Pero las partes básicas de este sistema pueden manipularse y utilizarse en diversos organismos eucariotas y tipos de células.
Hasta ahora, el sistema CRISPR/Cas9 se ha utilizado en varios organismos, como ratones, monos y, más recientemente, seres humanos.
Ha sido capaz de realizar modificaciones en células somáticas, incluidas las células madre, e incluso en células de la línea germinal, que pueden transmitir los cambios modificados de generación en generación.
Se han introducido algunas modificaciones en el sistema para su uso en esta gama de organismos y células. Para empezar, los componentes de CRISPR/Cas tienen que llegar a la célula que normalmente no tendría los componentes en su genoma.
Existen varios métodos de administración, cada uno con sus propios puntos fuertes, débiles y eficacia en distintos tipos de células.
Pero, sea cual sea el método utilizado, proporciona Cas9, una fusión de ARN de ARNcr y ARNtracr denominada ARN de guía única, o ARNgu o simplemente ARNg, y una especie de secuencia de código postal que lleva estos componentes al núcleo de la célula huésped.
Una vez allí, el ARNgu explora el genoma en busca del complemento de su secuencia diana. Cuando se une a Cas9, este ninja corta el ADN de doble cadena cerca de un PAM.
Estupendo. Ahora existe una brecha en el genoma del huésped y es aquí donde se produce la magia de la edición utilizando los propios mecanismos de reparación del ADN de la célula huésped.
Por lo tanto, si la rotura de doble cadena se repara mediante la unión de extremos no homólogos, se producirá una pérdida de la secuencia complementaria sin reemplazo.
Pero supongamos que se quiere poner nueva información genética en ese lugar, como si se quisiera cambiar un gen de betaglobina mutado para la anemia falciforme por un gen de betaglobina normal para curar la enfermedad, la reparación dirigida por homología también es posible.
Para ello, el ADN "donante" normal tendría que llegar a la célula huésped. Ese ADN "donante" actuará como una cromátida hermana de referencia para recrear la información genética perdida.
Pero supongamos que no queremos eliminar un gen, ni siquiera sustituirlo, sino simplemente silenciarlo durante un tiempo para averiguar qué hace.
Entonces se puede utilizar una proteína Cas9 defectuosa o inducible que haya perdido su capacidad de cortar el ADN. Esto significa que, cuando Cas9 se posa en el gen diana, se queda allí e impide su transcripción.
##RESUMENY ahora, un resumen rápido: el sistema CRISPR/Cas se produce de forma natural en procariotas para adquirir inmunidad adaptativa contra virus de ADN.
Pero el sistema se ha modificado para utilizarlo en diversas especies y células eucariotas. En estas células, un ARNgu se dirige a una parte específica del genoma y guía a la endonucleasa Cas9 para que realice una rotura de doble cadena.
Las roturas se reparan utilizando mecanismos de reparación de la célula huésped, como la unión de extremos no homólogos, en la que se produce una pérdida de información genética, o la reparación dirigida por homología, en la que el ADN "donante" introduce una nueva secuencia en el genoma.