Clonación de ADN

Cuando escuchas el término "clonación", puede que se te vengan a la cabeza imágenes de dos versiones de ti mismo, una que se pasa el día trabajando y la otra de fiesta como una estrella del rock.

Aunque eso podría ser posible en el futuro, por el momento la clonación funciona realmente a nivel de copia de un trozo de ADN (como un gen) muchas veces.

Pero esto es igual de genial y tiene enormes implicaciones. Básicamente, se trata de tomar un gen de nuestro ADN, insertarlo en un plásmido (que es un pequeño trozo circular de ADN bacteriano) y hacer que las bacterias multipliquen ese gen (replicación génica) y lo utilicen para fabricar proteínas para nosotros (expresión génica).

Nuestro ADN y el ADN del plásmido tienen algunas cosas en común: en primer lugar, ambos son moléculas de doble cadena, con cada cadena formada por secuencias de 4 nucleótidos (adenina, o A, guanina, o G, citosina, o C y timina, o T) dispuestos en un orden específico, como las palabras de una frase En segundo lugar, para formar la doble hélice, los nucleótidos utilizan sus bases (A, T, C, G) para formar enlaces de hidrógeno con las bases de la hebra opuesta.

Las bases forman enlaces según la regla del "emparejamiento complementario de bases", que establece que en el ADN, la A siempre se empareja con la T mediante dos enlaces de hidrógeno, mientras que la C siempre se empareja con la G, con tres enlaces de hidrógeno.

Sin embargo, la diferencia entre nuestro ADN y los plásmidos es que nuestro ADN está organizado en forma de 46 cromosomas lineales, mientras que los plásmidos tienen forma circular, como un collar de ADN molecular.

Ahora bien, el primer paso en la clonación de ADN es digerir nuestro ADN, que contiene el gen diana que queremos clonar, mediante el uso de enzimas de restricción que se unen a secuencias de nucleótidos específicas, llamadas sitios de restricción.

Hay un gran número de estas enzimas de restricción que reconocen cientos de secuencias de ADN diferentes (digamos que utilizamos la enzima de restricción ecoRI) que se une a cada secuencia G A A T T C del ADN, y rompe el ADN entre la G y la primera A.

Podemos utilizar esta enzima para escindir tanto nuestro ADN de doble cadena, que contiene el gen objetivo, como el ADN del plásmido, que es donde queremos insertarlo.

Para simplificar el ejemplo, digamos que tenemos un fragmento de ADN de doble cadena que tiene este aspecto, y recordemos que las dos cadenas de ADN son antiparalelas: una va de la dirección 5' a la 3', y la otra de la dirección 3' a la 5', un poco como dos serpientes enrolladas juntas pero orientadas en direcciones diferentes.

5’ A T C G A A T T C A A C A G C G T C G A A T T C 3’ 3’ T A G C T T A A G T T G T C G C A G C T T A A G 5’. Las partes en negrita son los sitios de restricción que reconoce ecoRI, y la parte entre ellos es el gen que queremos multiplicar.

Cuando añadimos un poco de ecoRI a este escenario, entra y muerde con fuerza entre la G y la primera A en el sitio de restricción en cada hebra, dejándonos con esto: 5’ A T C G A A T T C A A C A G C G T C G A A T T C 3’ 3’ T A G C T T A A G T T G T C G C A G C T T A A G 5'.

Aunque el ADN del plásmido es circular, hay que tener en cuenta que lo mismo sucede cuando ecoRI reconoce su sitio de restricción por allí.

Básicamente, lo que nos queda de nuestro ADN es nuestro gen diana, que termina con trozos de los sitios de restricción, lo que llamamos "extremos pegajosos".

Y el plásmido, igualmente, tiene ahora un hueco con extremos pegajosos a ambos lados. Hay que tener en cuenta que, junto con nuestro gen diana, también se inserta en el plásmido un gen de resistencia a los antibióticos.

Esto será útil más adelante, cuando queramos cultivar selectivamente solo las bacterias que contengan nuestro plásmido recombinante.

A continuación, se aplica un tipo de factor de estrés ambiental, como un choque térmico, que hace que la membrana de E. coli sea más permeable a los plásmido Sin embargo, no todas las bacterias responden bien a este tipo de tratamiento, por lo que mientras algunas de ellas incorporan los plásmidos, otras no lo hacen Para separar la población de bacterias que ha incorporado el plásmido y que, por tanto, contiene nuestro gen diana, las sacamos del tubo de ensayo y las trasladamos a una placa de agar nueva para cultivarlas.

Esta placa tiene todos los nutrientes que E. coli necesita para crecer y multiplicarse, pero con un giro: también contiene algún antibiótico espolvoreado.

Las bacterias que no han incorporado el plásmido carecen del gen de resistencia a los antibióticos, por lo que están prácticamente indefensas ante ellos y mueren.

Por otro lado, las que fueron lo suficientemente inteligentes como para permitir un plásmido en su interior llevan el gen protector que les permite multiplicarse a pesar del antibiótico.

A medida que estas bacterias se dividen, replican su ADN y también el plásmido, por lo que cada vez que el número de bacterias se duplica, también lo hace el número de plásmidos y, a su vez, nuestro gen diana.

Básicamente, esto significa que podemos utilizar las bacterias como "fábricas" de proteínas, es decir, transcriben nuestros genes junto con los suyos propios, y producen proteínas que podemos extraer y utilizar; por ejemplo, digamos que nuestro gen diana era el gen CFTR, que codifica una proteína llamada regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística, un canal de cloruro que transporta iones de cloruro dentro y fuera de las células.

Este gen está mutado en las personas con fibrosis quística, por lo que producen muy poca cantidad de esta proteína o una de forma anómala.

Sea cual sea el caso, no puede hacer su trabajo correctamente, por lo que los pacientes suelen tener problemas con el páncreas y los pulmones, y aunque estemos lejos de una cura genética para la fibrosis quística, algunos estudios han demostrado que utilizar un vector para incorporar las proteínas normales para luego administrarlas a los pacientes, puede mejorar la función pulmonar.

##Resumen Como breve resumen... La clonación de ADN se refiere a la multiplicación de pequeños trozos de ADN, como los genes, y utiliza pequeños trozos de ADN bacteriano circular llamados plásmidos.

El primer paso consiste en digerir nuestro ADN, que contiene el gen diana que queremos clonar, mediante el uso de enzimas de restricción que se unen a secuencias de nucleótidos específicas, llamadas sitios de restricción.

Se utiliza la misma enzima de restricción para escindir tanto nuestro ADN, que contiene el gen diana, como el ADN del plásmido.

Esto da lugar a un gen diana con extremos pegajosos, y a un hueco en el ADN circular del plásmido, que se unen como piezas de puzzle cuando se añade la ADN ligasa a la mezcla, y forman el ADN recombinante.

A continuación, los plásmidos se transfieren a la bacteria E. coli, y las bacterias se cultivan de forma selectiva, para producir múltiples copias del gen diana, o su producto proteico.