Hibridación fluorescente in situ

Definitions & Key takeaways

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a molecular cytogenetic technique that uses fluorescent probes to detect and localize the presence of specific DNA sequences on chromosomes. This technique can be used to detect chromosomal abnormalities, such as translocations, duplications, insertions, and deletions. FISH can also be used to identify and map the location of gene sequences on chromosomes.

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La hibridación fluorescente in situ es una técnica citogenética en la que se utilizan segmentos de ADN fluorescentes, denominados "sondas", que se unen a una secuencia de ADN conocida.
Se utiliza para localizar determinadas secuencias de ADN, o la ausencia de ellas, en un cromosoma con el fin de detectar anomalías cromosómicas o mutaciones, como la deleción, duplicación o translocación de un segmento de ADN, que pueden ser la causa subyacente de una enfermedad genética.
El ADN es como una biblioteca que se encuentra en el núcleo de las células y contiene la información genética. A nivel molecular, el ADN está formado por dos cadenas de nucleótidos que se enrollan una alrededor de la otra para formar una doble hélice.
Hay cuatro nucleótidos diferentes: la adenina, o A, la timina, o T, la citosina, o C, y la guanina, o G. La A se une a la T y la C a la G; los nucleótidos de las cadenas opuestas forman enlaces de hidrógeno para mantener las dos cadenas unidas.
Para encajar en el núcleo, el ADN se envuelve en proteínas que se condensan para formar fibras de cromatina. Estas fibras de cromatina están sueltas o compactadas dependiendo de la fase del ciclo celular.
El ciclo celular representa una serie de acontecimientos por los que pasan las células somáticas, es decir, todas las células aparte de los gametos, desde que se forman hasta que se dividen en dos células hijas idénticas.
Y tiene dos fases: la interfase, o crecimiento celular en preparación para la división, y la mitosis, o división celular.
Al principio de la interfase, las fibras de cromatina flotan en un estado suelto dentro del núcleo, como fideos ricos en ADN.
Cada uno de los fideos de cromatina representa una única molécula de ADN. Al final de la interfase, cuando la célula se prepara para la mitosis, o división celular, los fideos de ADN se replican y la cromatina se condensa para formar los cromosomas.
Las células somáticas humanas tienen 23 pares de cromosomas, es decir, 46 cromosomas en total. Justo antes de la mitosis, cada cromosoma lleva dos moléculas de ADN idénticas, llamadas cromátidas.
Las cromátidas se unen en el centro en una región llamada centrómero, que a su vez divide ambas cromátidas en un brazo "p" corto y un brazo "q" largo.
Por último, durante la mitosis, los cromosomas se condensan, por lo que pueden observarse con más detalle, y alcanzan su máxima condensación durante una fase de la mitosis llamada metafase, cuando se alinean perfectamente en el centro de la célula, como 46 pequeñas formas de X, donde cada lado de la X representa una cromátida.
Digamos, por ejemplo, que se sospecha que una persona tiene síndrome del maullido, o síndrome 5p-, que es cuando a un cromosoma 5 le falta el extremo del brazo corto.
Si se hace una hibridación fluorescente in situ, o FISH, en cromosomas en metafase puede verse si falta esa parte y confirmar el diagnóstico.
En la FISH en metafase, primero se prepara en el laboratorio un segmento de ADN de doble cadena, que está formado por la misma secuencia de nucleótidos que el extremo del brazo corto del cromosoma 5.
Esto puede hacerse gracias al proyecto del genoma humano, que determinó la secuencia de nucleótidos de todo el ADN humano.
Este segmento de ADN se llama sonda, y en realidad está formado por nucleótidos fluorescentes, que están marcados con moléculas coloreadas llamadas fluoróforos.
Los nucleótidos fluorescentes se ven como manchas coloreadas con el microscopio fluorescente. Los fluoróforos pueden tener diferentes colores.
Vamos a elegir el color rojo. A continuación, se coloca una muestra de las células de la persona en un portaobjetos de cristal.
Contienen los cromosomas con el ADN diana. Tanto el ADN diana como las sondas se calientan a unos 95 ºC.
Este paso se denomina desnaturalización, porque el calor rompe los enlaces de hidrógeno que normalmente mantienen unidas las cadenas de ADN.
Las cadenas separadas pueden hibridarse, lo que significa que cada cadena de ADN de la sonda se une a su secuencia de ADN complementaria en el cromosoma.
sí, el cromosoma se ha marcado con una "bandera roja" fluorescente. Si los dos cromosomas 5 de una persona tienen los brazos cortos completos, habrá cuatro manchas rojas: dos manchas por cada cromosoma, una por cada cromátida.
Pero como las cromátidas están muy juntas, es difícil diferenciarlas, por lo que aparecen dos manchas rojas: solo una mancha por cada cromosoma 5.
Si la microscopia solo muestra una mancha roja fluorescente, dos cosas son posibles. Una de ellas es que falta un cromosoma entero del par homólogo, y la otra es que solo falta una parte del brazo p.
Esto puede resolverse fácilmente añadiendo, desde el principio, una segunda sonda "verde" que se une al extremo del brazo q del mismo cromosoma.
Así, si hay dos manchas verdes, pero solo una roja, significa que hay un cromosoma 5 que está completo, y otro al que solo le falta parte del brazo p.
Esto se denomina deleción, y confirma el diagnóstico del síndrome del maullido, o síndrome 5p-. eamos un ejemplo.
Si se cogen 10 cm de lana blanca y se mancha aproximadamente 1 cm con un colorante rojo, es fácil ver el segmento teñido.
Pero si la lana se enrolla en una aguja de tejer, ese centímetro parecerá más pequeño y más difícil de ver. o mismo ocurre con la cromatina y los cromosomas.
Es más fácil observar un segmento de ADN teñido que está suelto, como la cromatina durante la interfase, que el mismo segmento apretado en los cromosomas durante la metafase.
Por lo tanto, si se desea detectar anomalías cromosómicas que afectan a un segmento de ADN relativamente pequeño, como duplicaciones o translocaciones, pueden obtenerse imágenes mejores con la FISH en interfase.
El proceso es básicamente el mismo: obtener la sonda, la muestra de la persona, desnaturalizar ambas y luego hibridarlas para hacer visibles los segmentos de ADN de los cromosomas.
Pero la diferencia radica en su aspecto bajo el microscopio: con la FISH en metafase, los cromosomas están condensados, mientras que con la FISH en interfase parecen más bien fideos de cromatina.
La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth es un ejemplo de duplicación, concretamente, la duplicación de un segmento de ADN en uno de los cromosomas 17.
Por ejemplo, el cromosoma que proviene de la madre tiene su segmento normal, y el cromosoma que proviene del padre tiene dos copias del mismo segmento; lo que hace un total de tres puntos "rojos" fluorescentes bajo el microscopio.
Igual que con la FISH en metafase, hay que ver si realmente hay solo dos cromosomas 17 y tres segmentos, o si realmente hay tres cromosomas 17.
Así que se puede añadir una segunda sonda "verde" desde el principio. Esta sonda se dirige a un segmento distante de ADN en el mismo par de cromosomas.
Así que si solo hay dos manchas verdes, significa que solo hay dos cromosomas, uno de ellos con una duplicación. Por último, un ejemplo clásico de translocación es el cromosoma Filadelfia, que es un cromosoma 22 con parte del cromosoma 9 en él.
Justo donde se juntan, hay una fusión entre el gen BCR (inicialmente en el cromosoma 22) y el gen ABL (originalmente en el cromosoma 9).
Así que hay un gen de fusión ABL- BCR que conduce a una división celular descontrolada que da lugar a un tipo de leucemia.
Aquí se vuelven a utilizar dos sondas diferentes: una roja que se une al segmento de ADN con el gen ABL en el cromosoma 9, y otra verde que se une al segmento con el gen BCR en el cromosoma 22.
Bajo el microscopio se ve una mancha roja, que corresponde al segmento de ADN normalmente localizado en un cromosoma 9; una mancha verde, que corresponde al segmento de ADN normalmente localizado en un cromosoma 22; y una mancha roja y verde en el otro cromosoma 22 con un poco de cromosoma 9 (o el cromosoma Filadelfia).
##Resumen Como breve resumen... La hibridación fluorescente in situ es una técnica citogenética en la que se utilizan sondas fluorescentes para localizar un segmento de ADN en un cromosoma.
Los pasos básicos son: obtener la sonda fluorescente, luego la muestra de la persona, desnaturalizar ambas y luego hibridarlas para hacer visibles los segmentos de ADN en los cromosomas o la cromatina.
La FISH en metafase se utiliza para analizar los cromosomas y detectar anomalías cromosómicas que afectan a un segmento de ADN relativamente grande, mientras que la FISH en interfase se utiliza para analizar la cromatina y detectar anomalías cromosómicas que afectan a un segmento de ADN relativamente pequeño.