Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)

Definitions & Key takeaways

Polymerase chain reaction (PCR) and reverse-transcriptase PCR (RT-PCR) are both techniques used in molecular biology. Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify a single copy of a DNA sequence and generate thousands or millions of copies of a particular DNA segment. It has a wide range of applications, including the diagnosis of genetic diseases, the identification of bacteria and viruses, and the cloning and sequencing of genes.

On the other hand, reverse-transcriptase PCR (RT-PCR) is used to amplify and detect RNA molecules. It is based on the same principles as PCR but uses reverse transcriptase to convert RNA into cDNA (complementary DNA) before the PCR reaction. RT-PCR can be used to detect viral RNA, and to measure the levels of gene expression in cells.

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El ADN contiene una gran cantidad de información muy comprimida para que quepa en el núcleo de una célu Una sola molécula de ADN tiene dos cadenas, que se envuelven una alrededor de la otra para formar una doble hélice Cada cadena de ADN está compuesta por una secuencia de cuatro tipos de nucleótidos, que son las letras individuales o los bloques de construcción del ADN.
Los nucleótidos del ADN están formados por un azúcar (desoxirribosa), un fosfato y una de las cuatro bases nucleicas (adenina, citosina, guanina y timina, o A, C, G y Los nucleótidos de una cadena forman enlaces de hidrógeno con los nucleótidos complementarios de la otra hebra; en concreto, la A se une a la T mediante dos enlaces de hidrógeno y la C se une a la G mediante tres enlaces de hidrógeno.
Además, las dos cadenas de ADN también tienen una "dirección", es decir, una de ellas va del extremo 3' al 5', mientras que la otra va del extremo 5' al 3'.
Algo así como dos serpientes enroscadas, pero orientadas en distintas direcciones. Todas las proteínas del organismo están codificadas mediante combinaciones de solo cuatro nucleótidos Cuando hay errores en la información genética, se producen enfermedades.
Y seamos sinceros, siempre nos interesó saber qué estaba escrito en nuestro AD La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica que se utiliza en biología molecular para amplificar un segmento de AD Demos un paso atrás.
Una sola copia de ADN no es mucho ADN. Así que para trabajar con el ADN, básicamente se hacen muchas copias del mismo para que sea más fácil de analizar.
Por ejemplo, para visualizarlo se puede utilizar una técnica llamada electroforesis en gel. La PCR se basa en la replicación del ADN, un proceso que las células utilizan normalmente para duplicar su material genético antes de dividirse en dos células hijas idénticas.
Para la PCR se utiliza una máquina llamada termociclado Se puede pensar en ella como un caldero lleno de una solución, donde los magos genéticos añaden los ingredientes Los ingredientes son el ADN que se desea multiplicar, una enzima llamada Taq polimerasa, cebadores específicos, que se unen al ADN, y una mezcla de nucleótidos libres: A, T, C y G.
Todos ellos se introducen en el termociclador. Supongamos que hay una molécula larga de ADN de doble cadena y nos interesa la parte resaltada Estas dos cadenas serían las del molde.
5’ - T T C A G G T C A C A G T C C T G T A T G C C T A T G T C C- 3’ 3’ - A A G T C C A G T G T C A G G A C A T A C G G A T A C A G G- 5’.
El primer paso de la PCR es la desnaturalización: los "ingredientes" se calientan a exactamente 96 ºC, casi tan caliente como el agua hirviendo.
Esto rompe todos los enlaces entre las dos cadenas de ADN para que puedan separarse la una de la otra El segundo paso se llama hibridación.
Aquí se necesitan los cebadores, y para nuestra secuencia resaltada, los cebadores tendrían este aspecto: <----3’- C G G A T A C - 5’ 5’ - A G G T C A C - 3’ ---> Durante el paso de hibridación se enfría todo a unos 55 ºC, y esto permite que los cebadores se unan a sus secuencias complementarias en el ADN monocatena El tercer paso se llama elongación: el entorno debe ser lo más óptimo posible para que la Taq polimerasa actúe.
La Taq polimerasa es una enzima muy útil. Se obtiene de una bacteria llamada Thermus aquaticus que crece en las fuentes termales geotérmicas.
La Taq polimerasa no solo puede soportar el calor durante la etapa de desnaturalización de la PCR, sino que además funciona mejor a unos 72 ºC.
Durante la elongación, se calienta todo de nuevo a 72 ºC, y la Taq polimerasa se une a los cebadores, toma algunos nucleótidos libres y ensambla las nuevas cadenas de ADN.
Y eso es prácticamente todo lo que hay que hacer. Un ciclo completo de PCR dura aproximadamente 10 minutos, y al final se ha duplicado la cantidad de ADN porque cada cadena molde de ADN es ahora de doble cadena Estos tres pasos se repiten unas 24 veces, y la cantidad de ADN se duplica en cada ciclo.
Dos cadenas, luego 4, luego 8, 16, 32, 64, 128, etc. Así que la PCR multiplica el ADN a un ritmo exponencial: después de unas 6 horas y 40 ciclos, teóricamente habrá 2^40, o sea, 1.099.511.627.776 copias de ADN que se pueden analizar.
Hay muchas variaciones de la PCR, pero vamos a hablar de una que se ha utilizado recientemente para diagnosticar una infección víric Para ello, hay que tomar un hisopo nasofaríngeo, es decir, obtener suficientes secreciones para analizarlas introduciendo un bastoncillo largo con un extremo blando y haciéndolo girar unas cuantas veces dentro de una fosa nasal.
Es fundamental obtener una buena muestra, si no hay ningún virus en el hisopo, la PCR no podrá detectarlo. Para diagnosticar la COVID-19 lo que se busca es un virus llamado coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave 2, o SARS-CoV-2.
El SARS-CoV2 es un virus con ARN, no ADN, por lo que para detectarlo habría que utilizar un tipo particular de PCR llamado PCR con transcriptasa inversa, o RT-PCR.
Esta técnica es un poco diferente, porque comienza con el ARN, en lugar del AD Una diferencia entre el ARN y el ADN es que el ARN no tiene timina; en su lugar, tiene uracilo.
Sin embargo, el ARN es complementario al ADN, por lo que si una cadena de ARN tiene una secuencia de nucleótidos, 3’-AAG UCC AGU-5’, la cadena complementaria de ADN, o ADNc, sería 5’- TTC AGG TCA -3’.
Para llevar a cabo la RT-PCR, parte de la muestra extraída del hisopo nasofaríngeo se añade a una solución que contiene una enzima llamada transcriptasa inversa, nucleótidos y cebadores complementarios a una secuencia diana específica del SARS-CoV-2.
Si el ARN vírico está presente, los cebadores se unen a la cadena de ARN y, a continuación, la transcriptasa inversa sintetiza una cadena de ADNc.
Una vez que tenemos el ADNc, los pasos de la RT-PCR son prácticamente los mismos que los de la PCR; se utiliza la polimerasa Taq para amplificar el ADNc mediante la desnaturalización, la hibridación y la elongación.
Después de varios ciclos, si había ARN del SARS-CoV-2 en la muestra original, se habrá amplificado el ADN de esa muestra que se puede detectar.
La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica que se utiliza para multiplicar masivamente el ADN, de modo que pueda ser analizado mediante otras técnicas.
Requiere un termociclador, en el que se introducen la muestra de ADN que se va a multiplicar, la Taq polimerasa termoestable, los cebadores con los que se selecciona lo que se multiplica y nucleótidos libres de los cuatro tipos: A, T, C y G.
El primer paso es la desnaturalización, luego la hibridación y, finalmente, la elongació